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明胶酶谱检测试剂盒正确的染色步骤!

明胶酶谱检测试剂盒正确的染色步骤!

 

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以无活性的酶原形式分泌,活化后能够降解细胞外基质的胶原蛋白,又称胶原酶。通过影响细胞外基质,胶原酶参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程,并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。血浆与组织中的MMP-2、MMP-9参与各种生理与病理过程,其在临床诊断和治疗中的意义日益受到重视。

 

MMP-2&MMP-9明胶酶谱法检测试剂盒检测步骤


1、  制备含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝胶:推荐分离胶浓度为8%。按照标准程序制备SDS PAGE凝胶。将10 × substrate G 融化,并90 ºC 加热5分钟。分别在浓缩胶和分离胶中额外加入10 × substrate G 并使之稀释10倍,混匀后加入过硫酸铵和TEMED,等待凝胶聚合。


2、待测样品1:1 稀释于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制:4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue),混合后直接上样。切勿加热变性,并且仅使用不加还原剂的上样缓冲液。可通过预试验确定加样量,使用普通蛋白预染Marker 即可。

阳性对照(可选步骤):可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血与100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等体积混合,取5-15μl 上样。


注:因为全血成分复杂,MMP活性较低,zui好的方法是将全血中白细胞进行分离做阳性对照


3、低电流恒流电泳,每一块小胶电流为20 mA/gel。溴酚蓝跑出凝胶前沿时结束电泳。


4、洗涤凝胶:取出凝胶,去除浓缩胶,放入容器内。可先用适量蒸馏水冲洗凝胶,然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸馏水稀释),室温漂洗凝胶2 × 30 分钟。中间换液。


5、 孵育:倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸馏水稀释),室温或37ºC 孵育1~5 小时。阳性对照或者血中的MMP 通常
37ºC 孵育1 小时即可显示。如MMP 活性低,应延长孵育时间为10小时或过夜。


6、显色:倒掉Buffer B,加入SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液(操作步骤见后面所附SDS-PAGE凝胶蛋白质考马斯亮蓝染色液说明书)。凝胶的大部分区域被深染,在有MMP 条带的位置不被染色而形成透亮区域。

透明区域的位置和范围指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。阳性对照将在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出现透明条带。

染色步骤:

 

1. 此染色液即为工作液,使用时直接将聚丙烯酰胺凝胶放在培养皿中以考马斯亮蓝染色液覆盖凝胶,并缓慢摇动2h;

 

2. 倾去染色液,用脱色液冲洗凝胶;

 

3. 以脱色液覆盖凝胶,缓慢摇动2h,倾去脱色液,再加入新脱色液进行脱色,直至获得清晰的蓝色的条带和干净的背景(通常此过程需要2~4h,也可脱色过夜至清晰的蓝色的条带和干净的背景);

 

4. 对凝胶进行分析和照相,凝胶可放置在7%的乙酸中保存。也可用凝胶干胶装置(P2000)对凝胶进行处理后保存。

 

安全性:含有甲醇,无特殊毒性,按一般化学品操作规程处理。

 

明胶酶谱检测试剂盒正确的染色步骤!

 

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